实验概要：本实验采用LOWRY法测定蛋白质含量，其在生物医疗领域具有重要应用价值。该方法结合了双缩脲法与福林酚法，具有较高的准确性和灵敏度，是检测生物样品中蛋白质的常用手段。

实验原理

LOWRY法的基本原理在于将蛋白质溶液与碱性铜溶液反应，形成铜-蛋白质络合物，随后加入酚试剂，使得酪氨酸、色氨酸及半胱氨酸等产生显色反应。此外，LOWRY法的显色效果较单用酚试剂强烈3～15倍，相对于双缩脲法增强达100倍。通过这一特点，该方法能够显著减少因不同蛋白质种类引起的测量偏差。

试剂组成

LOWRY法试剂由两部分组成：试剂甲为双缩脲试剂（碱性铜溶液），能与蛋白质肽键反应显色；试剂乙是磷钨酸与磷钼酸的混合物，加入酚类化合物后会产生蓝色反应，颜色深浅与蛋白质含量成正比。主要试剂包括Na2WO4•2H2O、Na2MoO4•2H2O、85%H3PO4、浓HCl、Li2SO4•H2O、溴水、酚酞指示剂、Na2CO3、NaOH、CuSO4•5H2O及酒石酸钾钠。牛血清白蛋白的浓度则配制为250mg/ml，用于标准化。

实验设备

实验所需设备包括：试管、各类刻度吸管、定量加样器、圆底烧瓶、一套冷凝管、微量滴定管、小烧杯、微量进样器（50μl）以及分光光度计等。这些设备为实验过程提供了必要的支持。

实验步骤

1. 制备酚试剂

首先在一个1500ml的圆底烧瓶中加入Na2WO4•2H2O（100g）、Na2MoO4•2H2O（25g）以及蒸馏水（700ml），然后添加85%H3PO4（50ml）和浓HCl（100ml），进行回流沸腾10小时。冷却后再加入Li2SO4•H2O（150g）、水（50ml）、浓HCl（100ml），继续回流沸腾15分钟以去除多余的溴。最后，将其稀释至100ml并过滤至棕色瓶中保存，使用时用标准NaOH溶液进行滴定，终点由蓝变灰。

2. 绘制标准曲线

编号7只试管，分别加入不同体积的标准蛋白质溶液，形成标准系列。添加5ml试剂甲，混匀后在30℃放置10分钟；接着喷射加入5ml试剂乙，立即振荡混匀并在30℃下保温30分钟。定时比色，绘制以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标的标准曲线。

3. 样品测定

取50μl样液加入试管，补充蒸馏水至1ml，重复上述步骤测量吸光度值。根据吸光度值查标准曲线求得样品中蛋白质含量。

4. 结果计算

蛋白质含量计算公式为：(C*V/a)/W，其中C为样品测定中的蛋白质含量（mg），V为提取液总量（ml），a为取样液量（ml），W为取样质量（g）。

注意事项

1. Folin试剂乙在酸性条件下稳定，加入到碱性铜-蛋白质溶液时需迅速混匀，以保证还原反应的及时发生。
2. 确保在25～30℃的水浴中进行反应，且在30分钟后准时比色。
3. 还原物质可能干扰实验结果。

结论

LOWRY法与考马斯亮蓝法均是高灵敏度的蛋白质定量测定方法，二者各有优劣，但在实际应用中，LOWRY法因其简便性与较高的准确性受到广泛欢迎。在不朽情缘MG的研究与开发中，LOWRY法将为蛋白质相关的生物医学研究提供强有力的支持。